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上海翻譯公司完成醫(yī)學(xué)“母嬰”中文翻譯

發(fā)布時間：2020-03-04 08:02　　點擊：

母乳喂養(yǎng)對產(chǎn)婦及嬰兒有多方面的優(yōu)勢，可減少產(chǎn)后出血，減少乳腺癌和卵巢癌的發(fā)病，并且在促進嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育方面有著無可比擬的優(yōu)越性[1]，但缺乳卻經(jīng)常困擾著較多產(chǎn)后婦女。在治療產(chǎn)后缺乳中，中草藥治療產(chǎn)后缺乳功效得到長期臨床經(jīng)驗的驗證，在民間也被廣泛的采納和接受。通草，為五加科類植物，是目前民間醫(yī)學(xué)及中醫(yī)中應(yīng)用最為廣泛的中草藥之一，它具有良好的通氣下乳的功效[2]，但目前國內(nèi)外學(xué)者對其藥用機理的研究甚少，關(guān)于其催乳的藥用機理及實驗室研究幾乎是空白。本實驗通過動物實驗及體外細胞實驗，運用熒光定量RT-PCR 方法及Western技術(shù)了解通草的藥理作用，初步探討通草在哺乳期增加乳汁分泌的途徑和作用機理，及其對乳汁成分的影響，為推廣通草在臨床上治療產(chǎn)后缺乳提供理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1材料

1.1.1、實驗動物：

遠交系清潔級ICR小白鼠，約20g左右，共16只隨機分為陰性對照組8只及通草組8只，均被分別放在36x48規(guī)格的塑料鼠籠中，在12h光照和12h黑暗的條件下進行喂養(yǎng)，環(huán)境溫度為20℃~25℃。

1.1.2、實驗儀器設(shè)備

Biotek連續(xù)光譜多通道酶標(biāo)儀(BioTek Synergy H1 Hybizl Render)，ABI Prism®7300 實時熒光定量PCR 儀，CO-150 CO2 培養(yǎng)箱，恒溫水浴，TGL-16G高速離心機（Thermo），化學(xué)發(fā)光成像儀（BIO-RAD, ChemiDoc XRS+），PCR 儀(GeneAmp PCR System 9700)，BIO-RAD小型垂直電泳槽（Mini-PROTEAN Tetra System）。

1.1.3、實驗試劑

RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco），F(xiàn)BS（Gibco），EGF（Sigma），胰島素（Sigma），M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（ABI），Trizol（Invitrogen），RIPA裂解液（Pierce），Western發(fā)光成像試劑盒（Pierce），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Pierce），乳糖測定試劑盒(Biovision)，熒光定量PCR 試劑盒（Takara）。

1.2 方法

1.2.1通草濃縮提純

通草提純濃縮制劑置備過程：選取通草藥材經(jīng)鑒定后，采用水提醇沉法提取有效組分[3]。將1公斤通草生藥在20倍蒸餾水浸泡24小時，然后放入100℃沸水浴中加熱4小時，過濾后保存提取液，重復(fù)上述過程2次，合并3次水煮液。用4層紗布過濾雜質(zhì)后，在3000rpm下離心15分鐘，取其上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，濃縮液加入無水乙醇，使?jié)饪s液中乙醇濃度達到75%，4℃靜置過夜，3000rpm下離心15分鐘，取上清液然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至4g生藥/ml，置冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>

1.2.2動物實驗設(shè)計

將16只產(chǎn)后ICR母鼠分成2組，陰性對照組8只及通草處理組組8只。通草處理組每日通過灌胃方式給予母鼠通草提取液約0.25 ml，陰性對照組給予等量生理鹽水。在哺乳第1，3，8，13，18天通過檢測幼鼠體重來計算母鼠每天泌乳量。具體將母鼠與幼鼠分離4h，然后重新合籠吸吮2h 后，分別稱取合籠前與合籠后幼鼠窩重，通過公式y(tǒng)ield(g/pup/day)=0.0322+0.0667(weight)+0.877(gain/d)得出母鼠的泌乳量，并進行兩組比較[4]。分離和合籠過程中盡量控制實驗室的溫度和濕度，避免光及聲音的刺激，避免驚擾，以減少對母鼠喂養(yǎng)及小鼠吮吸的影響。

1.2.3哺乳期血清催乳激素水平檢測

哺乳期第1，3，8，13天小鼠喂養(yǎng)稱重后（即每日下午4點左右），分別采集陰性對照組和通草處理組母鼠尾部血液，通過ELISA方法檢測血清中催乳激素的水平。

1.2.4乳汁中蛋白質(zhì)和乳糖含量測定

小鼠取奶前，腹腔注射2IU催產(chǎn)素，通過真空負壓采集乳汁用于檢測。通過BCA蛋白濃度檢測試劑盒與乳糖檢測試劑盒分別測定陰性對照組和通草處理組母鼠乳汁中蛋白質(zhì)和乳糖含量。

1.2.5小鼠乳腺上皮細胞培養(yǎng)

HC11小鼠乳腺上皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)條件為RPMI1640+10% FBS+胰島素(10ug/ml)+EGF(10ng/ml)。處理細胞前，先將細胞消化后移入6孔板中，使每孔細胞濃度均在1*10^5個/ml左右，將培養(yǎng)液換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基（RPMI1640+10ug/ml胰島素）。將細胞分為對照組、低劑量通草處理組和高劑量通草處理組。在培養(yǎng)液中加入通草提取液，使低劑量組和高劑量組通草終濃度達到100ug生藥/ml和500ug生藥/ml，對照組培養(yǎng)液中加入等量乙醇。細胞置于CO2 培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24小時。

1.2.6細胞總RNA抽提與熒光定量PCR

將對照組、低劑量通草組和高劑量通草組細胞通過Trizol抽提總RNA，采用的逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過SYBR Green方法進行熒光定量PCR，分別擴增內(nèi)參GAPDH、酪蛋白基因及乳清蛋白基因。引物如下：乳清蛋白基因上游引物：5’-CAAGAAGATCCTGGCTATCA-3’，下游引物：5’- AGATCATCTTCACAGGAATAGC-3’;β-酪蛋白基因上游引物：5’-TCACTCCAGCATCCAGTCACA-3’，下游引物：5’-GGCCCAAGAGATGGCACCA-3’; GAPDH 基因上游引物：5’-ACTCCCACTCTTCCACCTTC-3’，下游引物：5’-TCTTGCTCAGTGTCCTTGC-3’。

1.2.7 Western 印跡分析

將對照組、低劑量通草組和高劑量通草組細胞通過RIPA裂解液抽提總蛋白，通過Western方法檢測細胞內(nèi)酪蛋白、STAT5和磷酸化STAT的表達，Western具體方法參見文獻[4]。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析并繪制圖表。數(shù)據(jù)分析采用t檢驗或方差分析，分析結(jié)果以P值小于0.05作為有統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)準，小于0.01作為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)準。

2、結(jié)果

2.1通草對小鼠乳汁分泌量的影響

結(jié)果表明，通草組小鼠在哺乳的第1、3、8、13及18天的泌乳量均高于對照組小鼠的泌乳量，但其中第1天及第18天兩組乳汁量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而第3、第8及第13天通草組小鼠的泌乳量明顯高于對照組（P<0.05），有統(tǒng)計學(xué)差異。見圖1及表1。

注：*代表具有統(tǒng)計意義（P<0.05）

圖1 對照組和通草處理組小鼠乳汁分泌量

Fig1 Milk expression in control group and medulla tetrapanacis treated group

通草組泌乳量（g）n=8 對照組泌乳量（g）n=7 P值

產(chǎn)后第1天 0.2174±0.0096 0.2147±0.0121 >0.05

產(chǎn)后第3天 0.3963±0.0313 0.3600±0.0147 <0.05

產(chǎn)后第8天 0.6960±0.0465 0.6294±0.0252 <0.05

產(chǎn)后第13天 0.8977±0.0390 0.8316±0.0370 <0.05

產(chǎn)后第18天 1.0703±0.0482 1.0405±0.0503 >0.05

表1 對照組和通草處理組小鼠乳汁分泌量

Fig1 Milk expression in control group and medulla tetrapanacis treated group

2.2通草對母鼠血清催乳激素水平的影響

結(jié)果表明，通草組和對照組兩組在哺乳第1，3，8，13天催乳激素水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見圖2。

圖2 對照組和通草處理組小鼠血清催乳激素

Fig2 Serum PRL in control group and medulla tetrapanacis treated group

2.3通草對母鼠乳汁中蛋白質(zhì)及乳糖含量的影響

結(jié)果表明，通草組母鼠乳汁中蛋白質(zhì)濃度為119.567ug/ml，明顯高于對照組母鼠乳汁中蛋白質(zhì)的濃度100.562ug/ml（P<0.01），見圖3，通草組母鼠乳汁中乳糖濃度53.072mmol/L低于對照組母鼠乳汁中乳糖濃度63.290mmol/L（P<0.05），見圖4。

注：*代表具有統(tǒng)計意義（P<0.01）

圖3 對照組和通草處理組小鼠乳汁蛋白質(zhì)濃度

Fig3 Milk protein concentration in control group and medulla tetrapanacis treated group

注：*代表具有統(tǒng)計意義（P<0.05）

圖4 對照組和通草處理組小鼠乳汁乳糖濃度

Fig4 Milk lactose concentration in control group and medulla tetrapanacis treated group

2.4通草對HC11乳腺上皮細胞中酪蛋白和乳清蛋白表達的影響。

通過熒光定量PCR分析不同劑量通草提取液對HC11乳腺上皮細胞中酪蛋白和乳清蛋白mRNA表達的影響，見表2。結(jié)果顯示，低劑量通草和高劑量通草處理HC11乳腺上皮細胞能夠明顯增加β-酪蛋白的mRNA的表達（P<0.01），見圖5；低劑量通草和高劑量通草能夠明顯增加HC11乳腺上皮細胞乳清蛋白mRNA的表達量，但是低劑量通草對乳清蛋白mRNA表達量的影響沒有顯著差異（P>0.05），而高劑量通草對乳清蛋白mRNA表達量的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖6。

通過Western印跡分析不同劑量通草提取液對HC11乳腺上皮細胞中酪蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，高劑量通草提取液能夠明顯增加酪蛋白的表，見圖7。

組別 β-酪蛋白表達量乳清蛋白表達量

對照組 0.955±0.094 * 1.460±0.681

通草低劑量組 2.631±0.389 * 3.781±1.052

通草高劑量組 3.995±0.192 * 7.702±2.597 *

未帶“*”的兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）,其余組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）

表2 對照組、低劑量通草組和高劑量通草組用Real-time PCR檢測酪蛋白及乳清蛋白mRNA表達水平

Fig5 Expression of Casein mRNA and lactalbumin mRNA detected by real-time PCR in control group, low-dose and high-dose medulla tetrapanacis treated group

注：*代表具有統(tǒng)計意義（P<0.01）

圖5 對照組、低劑量通草組和高劑量通草組用Real-time PCR檢測酪蛋白mRNA表達水平

Fig5 Expression of Casein mRNA detected by real-time PCR in control group, low-dose and high-dose medulla tetrapanacis treated group

注：*代表具有統(tǒng)計意義（P<0.01）

圖6 對照組、低劑量通草組和高劑量通草組用Real-time PCR檢測乳清蛋白mRNA表達水平

Fig6 Expression of lactalbumin mRNA detected by real-time PCR in control group, low-dose and high-dose medulla tetrapanacis treated group

圖7 對照組、低劑量通草組和高劑量通草組用Western印記檢測酪蛋白表達水平

Fig7 Expression of casein detected by Western blot in control group, low-dose and high-dose medulla tetrapanacis treated group

2.5通草對HC11乳腺上皮細胞中STAT5信號通路的影響

通過Western印跡分析不同劑量通草提取液對HC11小鼠乳腺上皮細胞中STAT5和磷酸化STAT5的表達。對照組、低劑量組和高劑量組中總STAT5蛋白表達無明顯差異，但是通草處理能夠明顯增加STAT5的磷酸化水平，并且具有量效關(guān)系，見圖8。

圖8 對照組、低劑量通草組和高劑量通草組用Western印記檢測STAT5和p-STAT5表達水平

Fig8 Expressions of STAT5 and p-STAT5 detected by Western blot in control group, low-dose and high-dose medulla tetrapanacis treated group

3、討論

乳汁分泌由一系列復(fù)雜的生理過程組成，受到多種激素的調(diào)控，而對于乳汁生成最重要的激素是腦垂體前葉分泌的催乳激素[5]。催乳激素在整個泌乳過程中起到核心作用，它通過乳腺上皮細胞Jak／Stat通路促進乳汁分泌和誘導(dǎo)合成乳汁中重要的營養(yǎng)物質(zhì)[6]。目前，大多數(shù)促進乳汁分泌的西藥都通過中樞增加催乳激素水平,從而促進乳汁分泌。如多潘立酮，能夠干擾多巴胺抑制垂體前葉制造催乳激素的作用，間接使得催乳激素合成增加，增加泌乳[7]，但它同時可引起產(chǎn)婦出現(xiàn)胃腸道和心血管方面的副反應(yīng)[8]。中國傳統(tǒng)中藥通草在治療產(chǎn)后缺乳方面有其獨到之處，它的功效得到長期臨床經(jīng)驗的驗證，且作用溫和，副反應(yīng)小，在民間也被廣泛采納和接受。我們通過實驗研究通草的藥理作用，初步探討通草發(fā)揮催乳作用的途徑和機理。

實驗結(jié)果表明，通草組母鼠產(chǎn)后的泌乳量明顯高于陰性對照組母鼠，特別在第3天和第8天和第13天乳汁分泌量較陰性對照組母鼠有統(tǒng)計學(xué)差異。通過測定母鼠體內(nèi)催乳激素水平發(fā)現(xiàn)，通草組母鼠外周血中催乳激素水平雖有所升高，但其升高的水平較對照組相比并無統(tǒng)計學(xué)差異，可見通草可能并沒有作用于丘腦－垂體－性腺軸來增加催乳激素的分泌而達到促進乳腺細胞泌乳。通草處理HC11乳腺上皮細胞后，細胞內(nèi)總STAT5蛋白表達無明顯差異，但是STAT5的磷酸化水平明顯增加，并且具有量效關(guān)系。由此我們推測，通草可能直接作用于乳腺靶細胞，增加細胞信號傳導(dǎo)通路中轉(zhuǎn)錄激活因子STAT5的磷酸化水平，使細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)加強，從而促進乳汁的分泌；也可能通草作用后能夠增加細胞表面催乳激素受體數(shù)量或活性，導(dǎo)致細胞內(nèi)STAT5的磷酸化水平增加。而通草對于乳汁成份的影響主要是增加乳汁中蛋白質(zhì)的含量，特別是蛋白質(zhì)中乳清蛋白和酪蛋白的的含量，而對于乳汁中的乳糖卻使其含量減少，其原因和機制有待進一步研究探討。本實驗僅為對通草增加乳汁分泌的機理的一個初步探討，仍有些方面需深入實驗，以期對通草通乳的機理有全面的闡述。

總之，通草可以通過作用于細胞信號傳導(dǎo)通路中的轉(zhuǎn)錄激活因子STAT5，增加STAT5磷酸化水平，加強細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，增加乳腺細胞泌乳量和乳汁中蛋白含量，能有效治療產(chǎn)后缺乳。

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